腺病毒载体的构建

背景介绍

真核细胞常见的表达载体

• 质粒型表达载体
  

• 病毒型表达载体
  

• 病毒型载体常见类型
  
  1. 腺病毒表达载体
  2. 逆转录病毒表达载体
  3. 昆虫杆状病毒表达载体

腺病毒简介

• 腺病毒基本信息

• 腺病毒结构示意图

• 无包膜，核衣壳呈20面体立体对称，直径70～90nm
• 双链DNA
• 六邻体，每面12个，构成20面体的面及棱的大部分
• 五邻体，12个，位于20面体的12个顶点上，由基底和一根纤维凸起构成

• 腺病毒侵染细胞的过程

• 黏附和进入细胞大约需要6～8小时
• 转录和复制大约需要4～6小时

腺病毒载体简介

• 腺病毒载体的优点

• 与一般病毒载体相比具有的优点
  
  • 高转染效率
  • 高蛋白表达水平
  • 对转染效率很低的细胞进行高效转染（原代细胞等）
  • 可控拷贝数
  • 病毒粒子稳定，病毒基因重排率低
  • 安全性
  • 具有插入大片段外源基因的潜力
  • 宿主细胞较广泛

• 腺病毒载体的分类

• 第一代腺病毒载体：去除E1，E2区，插入外源基因的长度可达8kb
• 第二代腺病毒载体:去除E1，E2区的基础上又将E2A突变或E4区缺失，插入外源基因的长度可达14kb
• 第三代腺病毒载体：辅助病毒依赖型腺病毒载体，缺乏所有的编码序列，汁含有500bp的顺式作用元件，插入外源基因的长度可达36kb

• 腺病毒载体系统

• Adeasy系统：通过原核重组极大提高了腺病毒的重组效率

• AdMax系统：Cre/LoxP体系改造后的真核腺病毒包装体，进一步增加了操作的便捷性，同时滴度较Adeasy有进一步提高。

  腺病毒载体的构建

• 构建腺病毒载体的要素

• 腺病毒基因组质粒
• 穿梭质粒
• 目的基因片度
• 包装细胞

• AdMax系统

• 穿梭质粒－pDC315

• 腺病毒载体的包装细胞

• HEK293细胞——E1区缺陷互补的细胞系
  悬浮HEK293细胞，易于大规模培养，可以用于腺病毒的大规模制备。但是不易长期保持稳定
  单层培养HEK293细胞，稳定，用于重组腺病毒载体的构建，蚀斑挑选。也可用于腺病毒的扩增。

• HEK293细胞的培养
  高糖型DMEM
  10%FBS（构建），10％NBS（扩增）

• HEK293细胞的传代次数与腺病毒载体的构建和扩增
  构建：小于20代——构建成功的关键
  扩增：无特殊要求

以反义BTEB2腺病毒表达载体构建为例，介绍重组腺病毒载体的构建过程

• 外源性基因的制备

• VSMC中提取总RNA
• PT——PCR得到BTEB2，cDNA
  注意：从目的基因丰度高的组织或者细胞中提出较容易

• 重组穿梭质粒的构建——将PCR产物克隆到穿梭质粒

• 用BamHI和 EcoRI双酶切穿梭质粒pDC315及BTEB2 cDNA

• 用T4连接酶将BTEB2 cDNA反向连接到穿梭质粒——定向克隆
  注意：设计引物时引入需要的酶切位点可使基因定向克隆的程序简化

  

• 重组穿梭质粒的鉴定

• 酶切鉴定：用BamHI和 EcoRI双酶切穿梭质粒pDC315ASBTET2，电泳

• 目的片段的测序

• 重组腺病毒的制备

• 脂质体介导重组穿梭质粒和腺病毒基因组质粒转染细胞

• 实验步骤
  1.配制转染液
  2.混合转染液，室温孵育
  3.将混合的转染液与无血清DMEM混合
  4.倒出培养瓶中旧的培养液，加入上述混合液
  5.培养48小时后更换新鲜培养液

• 重组腺病毒的鉴定

• 取转染液离心

• 取上清液提取重组病毒DNA

• 用目的片段引物和病毒基因组特征片段引物作PCR

• 分离，纯化重组腺病毒最终得到反义BTEB2腺病毒表达载体

腺病毒载体的应用前景

• 腺病毒载体的应用优势：

1. 腺病毒载体转基因效率高,体外实验通常接近100%的转导效率
2. 不受靶细胞是否为分裂细胞限制
3. 容易制得高滴度病毒载体
4. 进入细胞内不整合到宿主细胞基因组，仅瞬时表达，安全性高

基于上述优势可能的应用

• 用于肿瘤基因治疗，腺病毒作为外源基因进入细胞的运输工具，以其高效和安全性成为最具前景的载体之一。

• 用于制作疫苗，这要求发展快速有力的纯化方法，实现载体的大规模生产。

参考文献

1.wikipedia,腺病毒,腺病毒载体及相关条目
2.腺病毒载体纯化及其在肿瘤基因治疗中的应用，庞小娟，李晓军，秦俊川，医学研究生学报
3.含hTK1和hTIMP1双基因共表达重组腺病毒载体的构建及对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响，黄舒洁，福建医科大学硕士研究生毕业论文
4.西农莎能羊FAS基因shRNA序列筛选及其腺病毒载体的构建，王伟，西北农业学报
5.腺病毒载体用于基因治疗的研究进展，胡奇婵，解放军医药杂志
6.反义BTEB2腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达，李德，医学研究生学报
7.腺病毒介导BTEB2反义RNA对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用，李德，第三军医大学学报